发酵稻草抑藻机理研究
吴小平,张平静
福建农林大学生命科学学院,福建福州350002
摘要:稻草在通气条件下经1个月发酵后,发酵稻草及其发酵液对鱼腥藻和念珠藻的生长具有显著的抑制效果,而对小球藻的抑制效果不明显,这说明发酵稻草的抑藻作用是有特异性的;经过灭菌的发酵稻草、没有经过发酵的稻草则没有抑藻作用,显示抑制藻类的物质是在稻草经过发酵后形成的,且该物质对热敏感。我们从发酵稻草中分离出21株微生物,发现其中一株(B3)具有和发酵稻草相同的抑藻效果,它能强烈地抑制鱼腥藻和念珠藻的生长,但它的发酵滤液没有抑制作用。本实验表明发酵稻草的抑藻作用是由于稻草在发酵过程中富集了某种微生物,这种微生物直接作用于藻类,使藻类的生长受到抑制,甚至死亡。
关键词:水华;发酵稻草;抑藻;微生物
水体富营养化是全球性环境问题,是指由于人类的活动,使得水体中营养物质富集,引起藻类以及其它水生生物过量繁殖,水呈绿色或混浊呈褐色,水体透明度下降,溶解氧降低,造成水质恶化,严重时发生“水华”,使得整个生态平衡发生改变而造成危害的一种污染现象。
当前湖泊富营养化的治理途径和对策,主要有如下几点①防止含有高浓度的氮和磷物质排放到水中;②形成“水华”的藻类对2,3一二氯-1,4-萘醌等化合物有高度专一性敏感,在富营养化水体中加人这种化合物可以去除水中的颜色,并可引起细胞裂解;③在水中引进合适的其他生物,如鱼苗、甲壳动物、或漂浮被子植物等,他们直接或间接以藻类为食,或消耗水中的营养物质,或影响藻类的光合作用等,从而抑制藻类的过度生长和控制其危害的程度;④形成水华的蓝藻可以受到相应微生物的控制,如真菌可以通过两个途径作用于有害藻类,一是释放抗生素或抗生素类的物质,二是寄生溶藻;⑤控制水华的另一种方法是用化学方法和生物方法从水体中去除含磷化合物。化学方法是利用生石灰、硫酸钒土和氯化铁对含磷化合物进行凝聚沉淀,从而去除水中含磷化合物。生物学方法则是利用一些能形成异染颗粒的细菌(如硝化细菌、反硝化细菌等)除去污水中含磷化合物。
上述各种治理方法多数处于实验和尝试阶段,成熟经验并不多。在国外,Newmen等报道了发酵大麦秸有效的控制水华发生的新途径。,Welch和Barret等报道了大麦秸可用于水渠或水库水华的控制。Nakai认为许多水生植物产生的化感物质能够抑制藻类的生长。
在国内 ,万宏等报道了稻草具有与大麦相似的性质。鉴于这种方法的经济性和安全性,以及我国水稻播种面积广阔,水稻资源极为丰富的具体情况,本文选择了稻草作为控藻研究的实验材料,探讨发酵稻草抑藻的作用机理。以期通过该研究探索出有效的、经济的、无二次污染的以及生态学风险小的控制水华发生的新方法。
1 材料与方法
1.1 稻草的发酵
将收割后的稻草剪成2c m长的小段,将稻草浸泡在自来水中(自来水在使用前放置2周,以除去自来水中的氯气),用气泵向浸泡有稻草的玻璃缸内充气,使稻草在有氧、20~30℃的条件下自然发酵,一个月后用于实验。
1.2 实验藻种及培养条件
实验藻种为鱼腥藻(Anabaenaa zolla)、念珠藻( Nostoc)、小球藻(Chlorella)以及从农大池塘取回的池塘混合藻。鱼腥藻、念珠藻、小球藻由福建农林大学微生物实验室提供,其中培养鱼腥藻和念珠藻的培养液为水生111号无氮培养基:K2HP040.075g ,MgSO4.7H20 0.0125 g ,CaC03 0.1g 、水1000 mL。培养小球藻和混合藻的培养基为Bristol培养液:NaN03 16 g, CaC12 1 g, MgS04.7H20 3 g,K2HP04 3 g, KH2PO4 3 g, NaCI 1 g、水1000 ML.培养条件:鱼腥藻、念珠藻、小球藻、混合藻的培养温度在20~30℃范围内,控制光强在1000-2500lx内,连续光照培养。
1.3 藻类生长的测定方法
藻类生长的测定方法采用测定水体中的叶绿素a含量的测定方法。
1.4 发酵稻草及其发酵液对各种藻生长的影响
将所得的各种藻进行富集培养,摇匀后分别取1 mL藻液加人到各个含有200 mL相应培养液的三角瓶中,并分别加人发酵稻草1 g, 3 g;灭菌发酵稻草1 g, 3 g;稻草发酵液1 mL, 3 mL;新鲜稻草(水浸24 h) 3g。各处理及空白对照(加水3mL)均设3次重复。每天观察记录培养液的变化。
1.5 发酵稻草的微生物分离
1.5.1 培养基
用牛肉膏蛋白陈培养基、马铃薯培养基、高氏1号培养基、VY/2培养基、培养基Ao
1.5.2 微生物的分离纯化方法
一般微生物的分离采用稀释分离法,纯化采用划线分离法。粘细菌的分离借鉴李越中的粘细菌分离方法,纯化采用抗生素法纯化。
6 微生物对藻类生长的影响
将分离纯化的21株菌分别培养于试管中。每种菌取试管一支,用无菌水8 mL洗得菌液后,于无菌条件下离心取沉淀,加人到含有鱼腥藻、念珠藻的培养液中。
选取有明显抑制效果的分离菌B3菌株,三角瓶液体培养,分别取3 mL菌液、3mL经细菌过滤器过滤的滤液及无菌水3 mL加入到含有鱼腥藻、念珠藻的培养液中,各处理均设3次重复。5d后测藻液的叶绿素含量。
2 结果与分析
2.1 发酵物对各种藻类生长的影响
从表1可知,发酵稻草对不同藻类生长的影响是不同的,发酵稻草对鱼腥藻,念珠藻生长的抑制效果最好。
加入湿热灭菌发酵稻草、新鲜稻草不但没有起抑制混合藻的作用,混合藻反而生长得更好。发酵液的抑藻效果也不明显。但是加入发酵稻草1 g, 3g的处理中,抑制混合藻生长的效果显著,在加入。
3g降解稻草的培养液中,7d后,藻类全部死亡。
发酵稻草对小球藻生长抑制效果不明显,实验中加入l g, 3g发酵稻草的培养液中没有出现抑制作用;但加入3 mL, 1 mL稻草发酵液的培养液中出现一定的抑制效果,显微镜下观察发现,培养液中出现一些浮游生物,包括一些纤毛虫类的原生动物,有的原生动物内含有被吞噬的小球藻细胞的食物泡,这说明原生动物对藻类有一定的控制作用。
鱼腥藻培养液中,加人3m L稻草发酵液,培养4d后藻死亡;加入3g发酵稻草的处理,3d后鱼腥藻死亡。稻草发酵液及发酵稻草对念珠藻的抑制作用与鱼腥藻相同。鱼腥藻、念珠藻为丝状藻,原生动物对其没有吞噬作用,因此发酵稻草对鱼腥藻、念珠藻的抑制作用,可能是稻草在通气发酵过程中富集的微生物在起作用。
作者认为经过灭菌的发酵稻草无效,说明在灭菌过程中微生物或其产生的活性物质遭到破坏失活。新鲜稻草无抑制作用说明有效微生物或活性物质要经过一定时间的好氧发酵才能产生。稻草在通气发酵过程中富集的微生物对小球藻无抑制作用;
稻草发酵液对小球藻有一定的抑制作用,这可能是稻草发酵液中存在的原生动物所致;原生动物在稻草发酵液中可能比在发酵稻草中多,因此稻草发酵液对小球藻抑制作用较强。富集的有效微生物在发酵稻草中可能比在稻草发酵液中多,因此发酵稻草对鱼腥藻、念珠藻的抑制作用强。
2.2 从发酵物中分离的微生物对藻类生长的影响
通过不同的分离方法,我们得到了21株菌株,它们均为细菌。由于发酵稻草对小球藻的抑制效果不好,因此这次试验只采用鱼腥藻和念珠藻。试验发现只有B3菌对鱼腥藻、念珠藻有抑制效果,在加入该菌4d后,藻类基本死亡,而加其它菌株的处理与空白对照相同。
从表 2可 知,B3菌液对鱼腥藻、念珠藻有显著的抑制作用,而滤液对鱼腥藻、念珠藻没有抑制作用,说明起作用的是菌体本身而非其产生的代谢物质。
B3菌株是通过李越中的粘细菌分离方法分离得到的,纯化采用抗生素法纯化,经初步研究该菌株可能是粘细菌。
3 讨论
本研究证明发酵稻草及稻草发酵液对鱼腥藻、念珠藻有很强的抑制作用,从发酵稻草中分离出的B3菌株也对鱼腥藻、念珠藻有很强的抑制作用,初步说明发酵稻草对蓝藻的抑制作用可能是由于稻草在发酵过程中富集了大量有效微生物— B3菌的结果,而这种菌对蓝藻的抑制作用是有特异性的,它对小球藻无抑制作用。稻草发酵液对小球藻的弱抑制作用可能与发酵液中存在的原生动物有关,万宏和张昀报道稻草的培养液中有许多浮游生物,有的原生动物内含有被吞噬的藻类细胞的食物泡。B3菌株的特性及其抑藻范围还有待进一步研究,微生物是否能用于控制水体富营养化还需深入探讨。 |